[摘　要]通過(guò)對(duì)豬和雞組織樣品中的克侖特羅、鏈霉素等獸藥的檢測(cè),比較了蛋白芯片檢測(cè)試劑盒、EL ISA檢測(cè)試劑盒和確證方法在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。結(jié)果表明:蛋白芯片檢測(cè)試劑盒與EL ISA試劑盒性能相當(dāng),與確證方法的結(jié)果有很好的一致性,且具有同時(shí)檢測(cè)多種獸藥,前處理方法簡(jiǎn)單、速度快等優(yōu)點(diǎn)。

    [關(guān)鍵詞]生物芯片;蛋白芯片;多殘留檢測(cè);樣品檢測(cè)

    蛋白芯片獸藥殘留檢測(cè)試劑盒集成了樣品前處理及樣品檢測(cè)過(guò)程,該項(xiàng)技術(shù)是二十一世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一種新的食品中獸藥殘留量檢測(cè)技術(shù)。目前,該試劑盒可以實(shí)現(xiàn)對(duì)豬肉、豬肝、雞肉、雞肝4種組織以及豬尿中恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶、鏈霉素、克侖特羅的半定量檢測(cè),除具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品前處理簡(jiǎn)單,檢測(cè)方便快速等優(yōu)點(diǎn)外,還可實(shí)現(xiàn)對(duì)上述多種獸藥同時(shí)并行檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),極大地節(jié)省了檢測(cè)費(fèi)用,縮短了檢測(cè)時(shí)間,進(jìn)而提高了檢測(cè)效率。筆者利用蛋白芯片獸藥殘留檢測(cè)試劑盒對(duì)動(dòng)物組織中幾種常用獸藥的殘留進(jìn)行了檢測(cè),并與其它方法進(jìn)行了比較。

    1　材料與方法

    1. 1　材料

    1. 1. 1　儀器與設(shè)備

    芯片掃描儀,晶芯mEcoScan-100,北京博奧生物芯片有限公司; 均質(zhì)器, JZ-Ⅱ型,中國(guó)鐵道部電化院四方電器設(shè)備廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, RE252AA型, 上海亞榮生化儀器廠; 離心機(jī),GL-20G-Ⅱ型,上海安亭科學(xué)儀器廠;酶標(biāo)儀,MK3型,芬蘭Thermo; 氣相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用儀, TRACEDSQ,菲尼根;液相色譜儀,四元梯度泵配2695紫外檢測(cè)器和2475熒光檢測(cè)器,Waters公司;自動(dòng)快速濃縮,DSY-Ⅱ型,北京金科精華苑技術(shù)研究所;多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀, ZY2300Ⅳ,北京威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司;恒溫培養(yǎng)箱, SGSP202型,黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;旋渦混合器, TDX-1型,通達(dá)科技。固相萃取柱: C18 , 100 mg/mL,含碳量≥16 (用于恩諾沙星殘留分析) ; SupelcleanLC-C18 Sep pak 500 mg/3 mL 和SCX小柱LC-SCXSep pak 500 mg/3 mL,美國(guó)SUPELCO公司(用于GC-MS法分析克侖特羅殘留) ;RIDA C18 , 德國(guó)拜發(fā)公司。

    1. 1. 2　EL ISA檢測(cè)試劑盒　

    克侖特羅殘留檢測(cè)試劑盒( 05073 ) 和磺胺二甲嘧啶殘留檢測(cè)試劑盒( EN5327) ,德國(guó)r2Biopharm公司;蛋白芯片獸藥殘留檢測(cè)試劑盒,批號(hào)20031202, 20040701,北京博奧生物芯片有限公司。

    1. 1. 3　試藥與試劑　

    鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品,批號(hào)0308-200012,效價(jià)712單位/mg;鹽酸克侖特羅對(duì)照品,批號(hào)0072-8501,含量99. 6%;磺胺甲噁唑?qū)φ掌?含量99. 0%;均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供?；前范奏奏?duì)照品,批號(hào)51K1523,含量99. 0%;磺胺甲氧噠嗪對(duì)照品,含量99%;磺胺二甲氧嘧啶對(duì)照品,含量99. 9%;磺胺甲氧嘧啶對(duì)照品,含量99%;磺胺喹噁啉對(duì)照品,含量97. 2%;沙丁胺醇對(duì)照品,含量99%;均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。硫酸鏈霉素及雙氫鏈霉素對(duì)照品,含量≥99% , Fluka 公司;環(huán)丙沙星對(duì)照品,含量≥99% ,B iometical公司。恩諾沙星對(duì)照,批號(hào)H010102,含量100. 1% ,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。甲醇和乙腈,色譜純, Fisher公司。

    1. 1. 4　實(shí)驗(yàn)用菌和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物　

    實(shí)驗(yàn)菌為枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis) ,菌株號(hào)為CMCC63501,由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性動(dòng)物為本所自己飼養(yǎng)添加藥物的10頭豬和29只雞(見(jiàn)表1) ,停藥2 d后屠宰取樣;陰性雞肉由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,陰性豬肉和肝超市采樣獲得;實(shí)驗(yàn)樣品部分來(lái)自市場(chǎng)和屠宰廠。

    1. 2　方法

    1. 2. 1　蛋白芯片試劑盒靈敏度評(píng)價(jià)

    1. 2. 1. 1　標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：將各種藥物對(duì)照品(標(biāo)準(zhǔn)品)按實(shí)驗(yàn)所需配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液,詳見(jiàn)表2。

    1. 2. 1. 2　芯片反應(yīng)：操作方法按獸藥殘留蛋白芯片檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1. 2. 1. 3　掃描及數(shù)據(jù)處理：芯片反應(yīng)完畢后進(jìn)行圖像掃描和數(shù)據(jù)處理,將校正后的熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)各對(duì)照品(標(biāo)準(zhǔn)品)溶液藥物濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求出每種藥物的IC50 (熒光信號(hào)強(qiáng)度下降一半的藥物濃度)值。

    1. 2. 2　蛋白芯片試劑盒特異性評(píng)價(jià)

    1. 2. 2. 1　標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：將各種藥物對(duì)照品(標(biāo)準(zhǔn)品)按實(shí)驗(yàn)所需配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液,詳見(jiàn)表3、4、5、6。

    1. 2. 2. 2　芯片反應(yīng)：按獸藥殘留蛋白芯片檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1. 2. 2. 3　掃描及數(shù)據(jù)處理：芯片反應(yīng)完畢后進(jìn)行圖像掃描及數(shù)據(jù)處理,將校正后的熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)各對(duì)照品(標(biāo)準(zhǔn)品)溶液藥物濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求出每種藥物的IC50值,再以芯片檢測(cè)目標(biāo)藥物交叉反應(yīng)率為100% ,按以下公式計(jì)算其它藥物(待測(cè)藥物B如磺胺喹噁啉等)與芯片檢測(cè)目標(biāo)藥物(參考藥物A,如磺胺二甲嘧啶)之間的交叉反應(yīng)率。

    藥物B的交叉反應(yīng)率=參考藥物A的IC50/待測(cè)藥物B的IC50 ×100%

    1. 2. 3　樣品前處理

    1. 2. 3. 1　蛋白芯片試劑盒：稱取5. 0 g粉碎后的樣品,放入離心管中,加入10. 0 mL組織樣品制備液,旋緊管蓋,用旋渦混合器劇烈混合2 min, 80 ℃水浴20 min,取出離心管,冷卻至室溫,以5 000r /min室溫離心10 min,然后吸取200μL的上清液轉(zhuǎn)移到1. 5 mL離心管中,加入800μL組織樣品稀釋液,蓋上管蓋,充分混合后即可用于檢測(cè)。

    1. 2. 3. 2　磺胺二甲嘧啶殘留測(cè)定(EL ISA法) ：稱取5. 0 g粉碎后的樣品與20 mL乙腈水溶液(86 +16)混合10 min, 15 ℃以6 000 r/min離心10 min,取3 mL上清與3 mL蒸餾水混合,加入4. 5 mL醋酸乙酯混合10 min, 15 ℃以6 000 r/min離心10 min,將醋酸乙酯層轉(zhuǎn)移至另一瓶中*干燥,用1. 5 mL稀釋了的緩沖液溶解殘?jiān)?加入1. 5 mL 正己烷混合5 min, 15 ℃以6 000 r/min離心10 min,*除去正己烷相,取50μL水相進(jìn)行分析。

    1. 2. 3. 3　磺胺二甲嘧啶殘留測(cè)定(HPLC法)按文獻(xiàn)[ 1 ]方法進(jìn)行。

    1. 2. 3. 4　鏈霉素殘留測(cè)定(微生物學(xué)法) [ 4 ]：稱取5. 0 g粉碎后的樣品,加入20 mL 磷酸緩沖液(pH 1. 5) ,勻漿后離心分離。取上清液用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8. 5,離心后取其上清液作為樣液。

    1. 2. 3. 5　克侖特羅殘留測(cè)定(EL ISA法) ：按試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行。

    1. 2. 3. 6 　克侖特羅殘留測(cè)定( GC2MS法) ：按NY/QY468 - 2001方法進(jìn)行[ 2 ] 。

    1. 2. 3. 7 　恩諾沙星殘留測(cè)定(HPLC法) ：按文獻(xiàn)[ 3 ]方法進(jìn)行。

    1. 2. 4　樣品測(cè)定：蛋白芯片獸藥殘留檢測(cè)方法,按獸藥殘留蛋白芯片檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;EL ISA法測(cè)定, 按磺胺二甲基嘧啶、克侖特羅的EL ISA檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行;磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星殘留檢測(cè)的液相色譜法分別按文獻(xiàn)[ 1, 3 ]方法進(jìn)行;鏈霉素在動(dòng)物組織中殘留的微生物學(xué)檢測(cè)方法,按文獻(xiàn)[ 4 ]進(jìn)行;豬尿中克倫特羅的(GC2MS)檢測(cè)方法按文獻(xiàn)[ 5 ]進(jìn)行;動(dòng)物組織中克侖特羅的測(cè)定(GC2MS) ,按參考文獻(xiàn)[ 2 ]進(jìn)行。

    2　結(jié)果

    2. 1　蛋白芯片試劑盒指標(biāo)測(cè)試結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)對(duì)用于獸藥殘留檢測(cè)的蛋白芯片相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了初步研究,各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表7、8。

    2. 2　蛋白芯片試劑盒與其他檢測(cè)方法樣品檢測(cè)結(jié)果比較：相同的樣品用蛋白芯片試劑盒檢測(cè)后,再用EL ISA試劑盒、抗生素微生物檢定法、HPLC法和GC - MS法等方法進(jìn)行了測(cè)定,依據(jù)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件中的獸藥zui高殘留*[ 6 ]判定樣品中的獸藥殘留是否超標(biāo)。結(jié)果如表9所示。

    3　討論

    3. 1　從1. 2. 1中可以看出,用蛋白芯片進(jìn)行獸藥殘留檢測(cè)的樣品前處理方法簡(jiǎn)單、速度快,且用同一種方法提取了多種獸藥,減少了樣品前處理時(shí)間(與其它方法比較情況見(jiàn)表10) 。

    3. 2　從表9得出,在對(duì)102份樣品的檢測(cè)中,其他方法檢測(cè)的陽(yáng)性樣品數(shù)為38,而蛋白芯片試劑盒檢測(cè)的陽(yáng)性樣品數(shù)為40,兩者有很好的符合率。用EL ISA試劑盒共檢測(cè)了58份樣品,其中陽(yáng)性樣品22份,而蛋白芯片試劑盒檢測(cè)的陽(yáng)性樣品為20份,兩者的符合率也較好。以上結(jié)果說(shuō)明蛋白芯片試劑盒結(jié)果可靠。

    3. 3　與其他方法相比,蛋白芯片試劑盒具有并行處理的能力,在一張芯片上可同時(shí)檢測(cè)2種以上的獸藥,目前的蛋白芯片試劑盒可同時(shí)檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶、克侖特羅、鏈霉素和恩諾沙星,可根據(jù)需要在一張芯片上檢測(cè)多種獸藥。

    4　結(jié)論

    生物芯片用于獸藥殘留檢測(cè)具有可同時(shí)檢測(cè)多種獸藥、準(zhǔn)確性高、前處理簡(jiǎn)單、速度快等優(yōu)點(diǎn)。

    目前用于獸藥殘留檢測(cè)的生物芯片正處于發(fā)展的初期,可檢測(cè)的獸藥種類相對(duì)較少,但初步實(shí)現(xiàn)了多殘留檢測(cè),顯示出生物芯片的并行性和高通量性,且生物芯片容易實(shí)現(xiàn)集成化和自動(dòng)化,在獸藥殘留的自動(dòng)化檢測(cè)上具有一定的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)是國(guó)內(nèi)外使用生物芯片對(duì)獸藥殘留進(jìn)行檢測(cè)。